Действие препарата Кагоцел на репродукцию вируса герпеса
Г. А. Галегов, А. Н. Наровлянский, А. А. Сарымсаков, М. В. Мезенцева, В. О. Полонский,
Модифицированные нуклеозиды на протяжении почти 20 лет играют ведущую роль в качестве средств лекарственной терапии различных герпетических поражений. Их механизм действия, основанный на эффективном ингибировании синтеза вирусной ДНК, лежит в основе надежного контроля за течением герпетической инфекции. Второй подход, реализуемый для ее лечения, определяется использованием иммуномодуляторов и индукторов интерферона. Этому посвящены исследования отечественных авторов [2]. Препарат "Кагоцел" известен как индуктор интерферона [3]. Вместе с тем его структурные особенности позволили предположить, что наряду с индукцией интерферона он может оказывать антигерпетическое действие, которое проявляется аналогично действию непосредственных ингибиторов репродукции вируса герпеса, т. е. не связанных с продукцией интерферона. Настоящее сообщение посвящено изучению действия оригинального отечественного препарата "Кагоцел" на репродукцию вируса герпеса простого, в том числе и мутантных штаммов этого вируса, резистентных к базовому антигерпетическому лекарственному препарату ацикловиру.
Материалы и методы
Клетки. В работе использовали перевиваемую культуру клеток Vero. Посевная доза составила 400 000 клеток/мл. В качестве ростовой среды применяли среду Игла, содержащую 300 мкг/мл глутамина, 10% эмбриональной телячьей сыворотки и 100 ЕД/мл бензилпенициллина.
Кагоцел — производное натриевой соли карбоксиметилцеллюлозы и госсипола (содержание последнего в препарате 3%) — представляет собой порошок светло-коричневого цвета, хорошо растворимый в воде. Производится ЗАО "Ниармедик плюс".
Ацикловир — 9-(2-гидроксиэтоксиметил) - гуанин (зовиракс) — в виде натриевой соли для внутривенных инъекций производства фирмы "С1ахо Wellcome" (Великобритания) использовали в качестве референс-препарата.
Цитотоксичность соединений определяли микрометодом в 96-луночных пластиковых планшетах ("Libro", "Flow Laboratories", Великобритания) методом окрашивания клеток трипановым голубым по стандартной методике. Через 72 ч инкубации при 37°С в атмосфере 5% СО2 определяли ЦД50— концентрацию соединения, в присутствии которой выживает 50% клеток.
Вирусы герпеса простого типа 1 (ВПГ-1) штамм Л2 и типа 2 (ВПГ-2) штамм ВН получены из Государственной коллекции музея вирусов Института вирусологии им. Д. И. Ивановского РАМН. Вирусы, устойчивые к действию ацикловира, фосфоноуксусной кислоты, комбинации ацикловира и фосфоноуксусной кислоты, были получены путем проведения серийного пассирования ВПГ-1 Л2 в градиенте концентраций соответствующих препаратов. Полученный материал трижды клонировали в соответствии с методом [5].
Вирусы поддерживали в культуре клеток путем пассирования. Множественность инфицирования составляла 0,01 БОЭ/мл. В качестве среды поддержки использовали среды Игла и 199 в соотношении 1:1 с добавлением 3% эмбриональной телячьей сыворотки.
Определение антивирусного действия препаратов. Вирусостатическое действие препаратов оценивали следующим образом: 1) в пластиковых микропланшетах в соответствии с методом [1, 4] по способности препарата защищать инфицированные клетки от гибели путем предотвращения развития вирусиндуцированного ЦПЭ. Множественность ин-фицирования в этих опытах составила 0,01, 0,1 и 1 lg БОЭ/клетка. Продолжительность инкубации составляла 72, 48 и 24 ч соответственно при 37°С в атмосфере СО2. Когда в контроле вируса развивался ЦПЭ на 95—100%, определяли величины ИД50 и ИД95 — концентрации соединения, которые предотвращали развитие вирусиндуцированного ЦПЭ соответственно на 50% и практически полностью; 2) по снижению инфекционного титра вируса. Монослои клеток, выращенные во флаконах вместимостью 50 мл ("Costar", США), заражали с множественностью 0,1 БОЕ/клетка. Инфицированные клетки инкубировали в среде, содержащей препарат в определенной концентрации. В качестве контроля использовали пробы со средой, не содержащей препарата. После 48 ч культивирования при 37°С, когда в контроле вируса развивался 95—100% ЦПЭ, флаконы с инфекционным материалом трижды замораживали—оттаивали, полученный материал центрифугировали. Инфекционный титр вируса в супернатанте определяли методом бляшкообразования. Клеточный монослой во флаконах вместимостью 50 мл заражали 10-кратными разведениями вируса и вносили среду покрытия, приготовленную на культуральной среде. Инфицированные культуры инкубировали при 37°С. Через 48 ч культуры фиксировали 5% нейтральным формалином и окрашивали метиленовым голубым. Титр вируса вычисляли по формуле Т= (п · k):V, где Т — инфекционный титр вируса (в БОЕ/мл); п — число бляшек во флаконе; k — использованное разведение вируса; V — объем внесенного во флакон вируссодержащего материала. Титр выражали в lg БОЭ/мл.
Химиотерапевтический индекс соединений (ХТИ) вычисляли как отношение ЦД50 к ИД50.
Определение вирулицидного эффекта препарата. Вируссодержащий материал инкубировали в присутствии препарата в известной концентрации в течение 30 и 60 мин при 20°С. Полученный материал титровали и определяли величину снижения ин-фекционного титра вируса по сравнению с контролем — вирусом, инкубируемым в тех же условиях, но без препарата.
Результаты и обсуждение
Из полученных результатов следует, что кагоцел характеризуется низкой токсичностью для культуры клеток Vero. Даже в максимально использованной нами концентрации препарата (1000 мкг/мл) количество погибших клеток через 72 ч составило 9,09% при гибели клеток в контроле 2,07%.
В табл. 1 представлены результаты изучения антивирусного действия кагоцела в культуре клеток с использованием эталонных штаммов ВПГ-1 и ВПГ-2, а также на моделях ВПГ-1 с измененной лекарственной чувствительностью.
| показатель | ВПГ-1 штамм Л2 | ВПГ-1 (Л2)-АЦВ-R | ВПГ-1 (Л2)-АЦВ/ФУК-R | ВПГ-2 штамм BH | ||||
| множественность инфицирорвания, БОЕ/клетка | ||||||||
| 0,01 | 0,1 | 1 | 0,01 | 0,1 | 0,01 | 0,1 | 0,01 | |
| Кагоцел | ||||||
| ИД50, | ||||||
| мкг/мл 3,9 15,6 62,5 12,0 62,5 31,2 250,0 7,8 | ||||||
| ИД95, | ||||||
| мкг/мл 31,2 62,5 250,0 92,5 250 250,0 500,0 62,5 | ||||||
| ХТИ > 256 > 64 > 16 > 83 > 16 > 32 > 4 > 128 | ||||||
| Ацикловир | ||||||
| ИД50, | ||||||
| мкг/мл 0,4 н. и. н. и. 120,0 н. и. 125,0 н. и. н. и. | ||||||
| ИД95, | ||||||
| мкг/мл 0,9 н. и. н. и. > 120,0 н. и. > 125,0 н. и. н. и. | ||||||
Примечание.АЦВ — ацикловир; ФУК — фосфорноуксусная кислота. ВПГ-1 (Л2)-АЦВ-R — вирус, резистентный к АЦВ; ВПГ-1 (Л2)-АЦВ/ФУК-R - вирус, резистентный к сочетанному действию АЦВ и ФУК. н. и. — не исследовали.
Из табл. 1 видно, что кагоцел оказывает выраженное избирательное антигерпетическое действие и способен полностью предотвращать развитие вирусоспецифического цитопатического эффекта в отношении всех включенных в исследование штаммов вируса герпеса. Наиболее выраженное антигерпетическое действие препарат оказывал на ВГТГ-1 с измененной лекарственной чувствительностью.
Антигерпетическая активность кагоцела существенно не увеличивалась при его внесении в экспериментальную систему за 2 ч до заражения клеток: при использовании множественности инфицирования 0,1 БОЭ/клетка (штамм ВПГ-1) величина ИД50 составила 7,8 мкг/мл, ИД95 — 31,2 мкг/мл.
Как видно из результатов, представленных в табл. 2, значительная антигерпетическая активность кагоцела была подтверждена снижением в его присутствии инфекционного титра вируса.
| Концентрация, мкг/мл | Титр, lg БОЕ/мл |
| 0 | 7,25 |
| 1000 | <1,0 |
| 250 | <1,0 |
| 62,5 | 4,64 |
| 31,2 | 5,88 |
| 15,6 | 6,12 |
| 7,8 | 6,29 |
| 1 | 6,48 |
Кагоцел не оказывал вирулицидного действия на ВПГ-1. После 60-минутного контакта вирусного материала с препаратом в концентрации 50 и 100 мкг/мл не наблюдалось существенного снижения инфекционной активности вируса по сравнению с контролем вируса. Соответствующие данные приведены в табл. 3.
| Концентрация, мкг/мл | Экспозиция, мин | |
| 30 | 60 | |
| Титр, lg БОE/мл | ||
| 0 | 5,12 | 4,76 |
| 50 | 5,04 | 4,67 |
| 100 | 4,99 | 4,53 |
Таким образом, на основании представленных данных можно констатировать, что кагоцел обладает низкой цитотоксичностью для культуры клеток Vero, выраженной способностью подавлять репродукцию ВПГ-1, а также ВПГ-2 в культуре клеток Vero в нецитотоксичных концентрациях, выраженной способностью подавлять репродукцию штамма ВПГ-1, обладающего резистентностью к ацикловиру, и штамма с двойной резистентностью к ацикловиру и фосфоноуксусной кислоте.
Поскольку ранее была четко показана интерферониндуцирующая активность кагоцела [3], обнаружение у него прямой антигерпетической активности in vitro открывает перспективу его дальнейшего изучения, в частности, в комбинации с ацикловиром (ациклогуанозином) как препаратов, обладающих принципиально различными механизмами действия на герпетическую инфекцию. Немаловажно, что в условиях комбинированного воздействия на вирусную инфекцию предотвращается формирование вариантов вирусов с лекарственной устойчивостью, что очень важно в клинической практике при лечении людей с различными формами герпетической инфекции.
